Nghiên cứu khả năng phân giải Cacbuahydro cùa một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

bằng phương pháp trên vẫn còn 1 lượng dầu nhỏ trên mặt biển. Hơn nữa, khi
lượng dầu tràn bị sóng đánh vào bờ, nhanh chóng thấm vào đất liền dẫn đến
suy thoái vùng sinh thái nơi này [42], [47].
Sử dụng VSV phân giải dầu là biện pháp hiện nay đang được thế giới
nói chung và Việt Nam nói riêng quan tâm để loại bỏ phần dầu còn sót lại ảnh
hưởng đến vùng ven bờ [43]. Biện pháp này với tính ưu việt của nó là xử lí
triệt để lượng dầu mà không gây ô nhiễm mô
i trường, ngay ở cả môi trường
nước, cát, đá. Đồng thời, trong quá trình phân giải dầu các VSV này tạo sinh
khối, cung cấp dinh dưỡng cho chu trình trong hệ sinh thái. Nhiều công trình
nghiên cứu về VSV phân giải dầu ở các khu vực có nhiễm dầu khác nhau
[1],[17],[20],[21],[23],[24],[26], nhưng về VSV có khả năng phân giải dầu
của hệ VSV ở RNM còn ít đề tài quan tâm, đặc biệt là nấm sợi. Vì vậy, việc
tìm kiếm các chủng nấm sợi thích hợp trong khu hệ VSV đa dạng tự nhiên
RNM, tiềm năng ứng dụng của chúng trong công nghệ sinh học làm sạch môi
trường là cần thiết. Chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả
năng phân huỷ các hợp chất cacbuahydro của một số chủng nấm sợi
phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm hiểu khả năng phân giải cacbuahydro của một số chủng nấm sợi
phân lập từ RNM Cần Giờ.
3. Đối tượng nghiên cứu
Các
chủng nấm sợi được phân lập từ RNM Cần Giờ có khả năng phân
giải hợp chất cacbuahydro.
4. Phạm vi nghiên cứu
Đất, lá cây, thân cây là nguôn phân lập nấm sợi ở RNM thuộc bảy xã:
An Thới Đông, Bình khánh, Cần Thạnh, Lý Nhơn, Long Hoà, Tam Thôn
Hiệp, Thạnh An của huyện Cần Giờ.




5. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập nấm sợi từ đất, lá cây, thân cây ở một số khu vực RNM
Cần Giờ.
- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng phân giải
cacbuahydro cao.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại các chủng được tuyển
chọn. Định danh đến loài.
- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả
năng phân giải dầu của chủng nấm sợi tu
yển chọn.
- Đề xuất hướng ứng dụng
6. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp VSV.
- Phương pháp Sinh học.
- Phương pháp toán học.
7. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường ĐHSP TP. Hồ Chí Minh và PTN
viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh.
8. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 04 năm 2006 đến tháng 08 năm 2007.












Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm khu bảo tồn sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ
Rừng ngập mặn (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài thực vật
hoặc một khu rừng có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển.
Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng-ẩm. Theo đánh giá của GS.
Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng 16.670.000
ha. Trong đó, khu vực châu Á có diện tích lớn nhất. Theo thống kê ban đầu
của FAO, diện tích RNM ở Việt Nam khoảng 320.000 ha chiếm một phần khá
lớn so với các nước trong khu vực [3
].
Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển RNM thế giới đầu tiên ở Việt Nam
được UNESCO công nhận vào 21/01/2000. Nằm ở phía đông nam Thành phố
Hồ Chí Minh ở vĩ tuyến 10
o
22’14” đến 10
o
40’09”, kinh tuyến 106
o
46’12” đến
107
o
00’59”. Diện tích khoảng 75.750 ha với diện tích rừng là 38.664 ha trên
nền đất phù sa chủ yếu do sông bồi đắp[3],[42].
RNM Cần Giờ phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn
và Đồng Nai mang đến, lắng đọng thành nền đất. Theo thuyết khô hạn sinh lý
học của Schimper thì đây là yếu tố chính hình thành RNM. Đất RNM được
tạo bởi quá trình trầm tích sét, phèn hoá và nhiễm mặn: Lớp đất sâu chưa ổn
định, đất chứa nhiều muối. Bốn loại đất chính: Đất mặn, đất mặn- phèn ít, đất
mặn-phèn nhiều, đất cát
mịn có pha một ít bùn ven biển; nhưng diện tích đất
mặn chiếm ưu thế. Đất RNM có nồng độ muối cao, vào mùa nắng 4‰ - 18‰,
còn mùa mưa độ mặn cao hơn từ 24‰- 30‰, độ pH trung bình khoảng 6.8-
7.2, nhiệt độ trung bình 26
o
C – 29
o
C, độ ẩm 74% - 83%. Cũng giống như các
RNM khác, đất RNM Cần Giờ có độ ẩm cao. Nhờ sự vào ra của thuỷ triều và
được che phủ bởi các tán lá cây ngập mặn nên đất ở đây hiếm khi trải qua thời
kì khô hạn kéo dài. Khí hậu RNM Cần Giờ mang đặc tính nóng ẩm, chịu chi




phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với 2 mùa mưa nắng rõ rệt. Có chế độ
bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày
[3], [44], [45].
Hệ sinh thái ở RNM cũng mang các nét đặc trưng của các hệ sinh thái
khác: Dòng năng lượng, chuỗi thức ăn, đặc trưng phân hoá theo không gian
và thời gian, vòng tuần hoàn vật chất. Trong hệ sinh thái này, thực vật chủ
yếu là các loại như: Mắm, Sú, Bần, Đước, Trang, Dừa nước, Đưng, Dà … có
157 loài t
hực vật thuộc 76 họ. Sinh vật tiêu thụ gồm: 63 loài phiêu sinh vật,
130 loài tảo thuộc 3 ngành: Tảo Khuê, Tảo Giáp, Tảo Lam. 100 loài động vật
đáy như: Tôm, cua, sò, ốc. Ngoài ra, còn có 120 loài cá trong đó có các loài
có giá trị kinh tế cao như cá Ngát, cá Dứa, cá Chếm. 31 loài bò sát như: Cá
Sấu Hoa cà, trăn, rắn, kì đà nước. 19 loài hữu nhũ như: khỉ, heo rừng, rái cá,
mèo rừng và 145 loài chim như: Ác là, Bồ Nông chân xám [44]. Vi sinh vật
đặc biệt là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn là các tác nhân quan trọng t
rong quá
trình phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các loài sinh vật khác
trong hệ sinh thái RNM. Các VSV này có thể sống hoại sinh trong đất, lá
mục, thân mục, một số sống kí sinh hoặc cộng sinh trong cây hay côn trùng.
Phức hợp quần xã VSV phân giải protein, xenlulose, cacbuahydro, kitin…
cung cấp mạnh vật chất và năng lượng cho chu trình tuần hoàn trong suốt cả
hai pha của chu kì thủy triều. Hệ sinh thái RNM nằm ở lưu vực ven bờ có
nhiều thành phần cacbon phức tạp do thuỷ triều đưa v
ào. VSV đóng vai trò
quan trọng trong việc phân hủy các hợp chất độc có tính bền vững cao, trong
đó có dầu. Với dầu, VSV không chỉ có khả năng phân hủy cacbuahydro mạch
thẳng, cacbuahydro thơm đơn nhân hay đa nhân mà còn có khả năng phân
hủy các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh. Vì vậy, hệ VSV ở đây góp phần
rất lớn trong quá trình làm sạch các hợp chất này. Đặc biệt là nấm sợi phân
giải các chất hữu cơ trong t
hảm thực vật, động vật ở RNM. Góp phần làm




giảm sự ô nhiễm MT trong đó có ô nhiễm dầu. Khu hệ VSV ở RNM

có khả
năng phân giải các chất hữu cơ cho điều kiện không có oxi, trong suốt mùa lũ
lụt và điều kiện có oxi trong suốt kì phơi ải [37].
Đây là hệ sinh thái có năng suất sinh học cao nhất trong các hệ sinh thái,
nơi hội tụ sự đa dạng của cả sinh vật biển và đất liền. Vì vậy, nó chính là
phòng thí nghiệm sống, để nghiên cứu về khả năng chịu đựng và phục hồi của
các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng sống. Đặc biệt là
năng suất sinh sản của các quần thể nấm sợi phân giải cacbuahydro sau khi

môi trường bị đảo lộn bởi con người do nhiễm dầu [44],[47].
1.2. Tổng quan về nấm sợi
1.2.1. Đặc điểm sinh học
1.2.1.1 . Điểm hình thái, cấu trúc
Nấm sợi thuộc nhóm vi nấm (filamentous fungi), có kích thước hiển
vi. Chúng là một hệ sợi phức tạp, đa bào có màu sắc phong phú (hì
nh 1.1a).
Nấm sợi có cấu tạo cơ quan sinh sản với nhiều hình thức sinh sản khác nhau.
Đây là một trong những tiêu chuẩn chủ yếu để phân loại chúng [7],[8].
Cơ thể nấm là một tản (thallus). Tản nấm được cấu tạo từ hệ sợi nấm
hay thể khuẩn ty (mycelium) do các sợi nấm hay khuẩn ty (hypha) phân nhánh
tập hợp lại. Những sợi này sinh trưởng ở đỉnh [7
],[11],[12]. Khuẩn lạc của
nấm sợi thường tròn, cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc của xạ khuẩn,
nhưng khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn (hình 1.1b). Bề mặt
len xốp hoặc mịn. Thường thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích
thước 5- 10 μm, trong khi đó khuẩn lạc của xạ khuẩn chỉ 0.5- 2 μm.









vác
h

sợi có vách ngăn Sợi không vách ngăn
vác
h



sợi có vách ngăn Sợi không vách ngăn
a
) b)

Hình 1.1: a) Các loại sợi nấm b) Hình thái khuẩn lạc
[Nguồn: sinhhocviet.com.vn]
 Khuẩn ty: Là những sợi nấm phân nhánh, phát sinh từ bào tử mà ra.
Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn ngang (septum), các sợi nấm
không có vách ngăn ngang gọi là sợi cộng bào (coenocystic). Một số sợi nấm
có thể tiết sắc tố vào môi trường hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi
nấm. Đa số sợi nấm
phân nhánh nhiều lần nhưng cũng có sợi nấm không phân
nhánh. Nấm sợi không có diệp lục do đó không có khả năng tiến hành quang
hợp, chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt của
khuẩn ty.
Có 2 loại khuẩn ty:
- Khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt cơ chất, từ đây sẽ có một số
sợi phát triển thành các cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử.
- Khuẩn ty cơ chất phát triển sâu vào cơ chất, giúp nấm sợi bám
chặt vào
cơ chất và hấp thụ các loại thức ăn chứa trong đó.
 Bào tử: Là cơ quan sinh sản chủ yếu của nấm sợi. Khi nấm sợi
trưởng thành sẽ xuất hiện khuẩn ty khí sinh, từ khuẩn ty khí sinh sẽ sinh sản
ra bào tử.
Nấm là VSV có nhân chuẩn thành tế bào nấm cấu tạo chủ yếu là kitin-
glucan, kitozan, rất ít nấm có thành tế bào là xenluloza [7
],[12],[16].






1.2.1.2 . Đặc điểm sinh lí, sinh hoá
Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp thụ qua màng nên không có
cơ quan tiêu hoá. Nấm sợi không có diệp lục nên không có khả năng quang
hợp. Chúng thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ, sử dụng được nhiều
nguồn cacbon khác nhau. Phần lớn nấm sợi là các cơ thể hoại sinh, một số kí
sinh gây bệnh cho người và động vật.
Các loại nấm sợi thường có nhu cầu khác nhau về nguồn ni
tơ,
photpho. Chúng có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ. Ngoài ra, sự
sinh trưởng của nấm sợi ở RNM liên quan đến các nguyên tố vi lượng, các
vitamin, độ mặn trong môi trường nuôi cấy. Tuỳ thuộc vào chủng nấm ưa
mặn cực đoan hay ưa mặn tuỳ ý, mà nồng độ muối thích hợp dao động từ
0%- 3%.
Ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm sợi còn có yếu tố độ ẩm
, nhiệt độ
môi trường. Nấm sợi tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25-30
o
. Đa số nấm sợi sinh
trưởng tốt ở pH=7. Riêng loài Trichoderma thích hợp ở môi trường axit.
1.2.1.3 . Đặc điểm sinh sản
Nấm sợi là một trong những VSV có nhiều kiểu sinh sản khác nhau,
nhưng chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc
hữu tính.
 Sinh sản sinh dưỡng:
 Phát triển bằng khuẩn ty: Những đoạn nấm riêng rẽ có thể phát
triển thành khuẩn ty. Trong lòng khuẩn ty này có thể thấy xuất hiện một hay
nhiều tế bào hình cầu, có m
àng dày bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ.
Khi gặp điều kiện thuận lợi, các tế bào này lại tiếp tục phát triển thành một sợi
nấm mới.
 Sinh sản bằng hạch nấm: Một số nấm lại có khả năng tạo thành
hạch nấm. Đây là một khối có hình t
ròn không đều, màu tối. Bên trong là một




tổ chức sợi xốp và thường có màu trắng. Hạch nấm có thể giúp cho cơ thể
nấm vượt qua những điều kiện khó khăn. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng
lại phát triển bình thường.
 Sinh sản vô tính bằng bào tử:
Các bào tử vô tính khác nhau về hình dạng và cách phát sinh, căn
cứ vào đặc điểm phát sinh chia làm 3 loại bào tử vô tính:
 Bào tử động (zoospores): Gặp ở các lớp ngành phụ Mastigo-
my
cotina, bào tử vô tính có roi, phát sinh trong nang bào tử động. Nang có thể
do toàn bộ sợi nấm đơn giản biến đổi thành. Nang khi chín sẽ mở nắp cho các
BT chui ra. Hình 1.2a
 Bào tử kín (gymnospores): Gặp ở ngành phụ Zygomycotyna.
Các BT kín không có roi, tạo ra trong nang kín. Khi nang chín sẽ nứt ra và
phóng thích BT ra ngoài. Hình 1.2b
 Bào tử trần (conidi, angiospores): Là loại BT phát sinh bằng
con đường ngoại sinh hay nội sinh, nhưng đều được giải phóng ra phía ngoài
của tế bào sinh bào tử. Bào tử trần (BTT) có nhiều loại: Loại không có vách
ngăn ngang (Aspergillus spp, Penicillium spp…), loại có một vách ngăn
ngang (Tri
chothecium spp, Arthrobotrytis spp…), có từ hai vách ngăn ngang
trở lên (Fusarium spp, Helmilthosporium spp…), có cả vách ngăn ngang lẫn
vách ngăn dọc xen kẽ hoặc nối tiếp nhau (Alternaria spp…). Hình 1.2c

a b c
Hình 1.2:
Các dạng BT vô tính [Nguồn:sinhhocviet.com.vn]
(
a: BT động; b: BT kín; c: BT trần)




 Sinh sản hữu tính
Nấm sợi cũng có hình thức sinh sản hữu tính giống các sinh vật
bậc cao, đó là quá trình chất giao (plasmogamy) nhân giao (caryogamy) và
quá trình giảm phân (meiosis).
* Lớp nấm roi thực hiện bằng cách đẳng giao, dị giao và noãn giao.
 Đẳng giao: Sợi khuẩn ty sinh ra các túi giao tử trong có chứa
giao tử. Các giao tử sau khi ra khỏi túi kết hợp với nhau tạo thành hợp tử.
Hợp tử phân chia giảm nhiễm thành các BT. Mỗi BT khi được giải phóng ra
từ hợp tử có thể phá
t sinh thành sợi nấm. Các giao tử và túi giao tử hoàn toàn
giống nhau giữa cơ thể “đực” và cơ thể “cái”.
 Dị giao: Là trường hợp các giao tử và túi giao tử ở cơ thể
“đực” và cơ thể “cái” khác nhau.
* Lớp nấm tiếp hợp: Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp (zygospore), hình
1.3c. Từ hai khuẩn ty khác nhau gọi là sợi âm và sợi dương mọc ra hai mấu
lồi gọi là nguyên phối nang. Các nguyên phối nang mọc hướng vào nhau, mỗi
nguyên phối nang sẽ xuất hiện một vách ngăn phân tách hai phần đầu của hai

nguyên phối nang thành hai tế bào đa nhân (đơn bội). Hai tế bào đa nhân tiếp
hợp với nhau tạo thành hợp tử đa nhân lưỡng bội, có màng dày bao bọc gọi là
bào tử tiếp hợp. Ngoài ra, nấm tiếp hợp còn có dạng sinh sản chỉ phối sinh
chất không phối nhân, do đó tạo thành hợp tử có nhiều nhân nhưng đơn bội.
* Nấm đảm
: Sinh sản bằng bào tử đảm (basidiospore)- hình 1.3b, là BT
thực hữu tính được tạo thành bên ngoài tế bào sinh bào BT đặc biệt gọi là
đảm (basidium). Khi chín phát tán bằng cách rụng khỏi đảm.
* Nấm túi: Sinh sản bằng bào tử túi (ascospore)- hình 1.3a, các bào tử
này được hình thành trong túi bào tử. Bào tử chỉ phát tán khi túi già và mở ở
đỉnh hoặc khi vỏ túi bị phân huỷ.





a) b) c)
Hình 1.3: Các dạng BT sinh sản hữu tính [Nguồn: sinhhocviet.com]
a) BT túi b) BT đảm c) BT tiếp hợp
Nấm không có chu trình phát triển chung, có các chu trình phát triển
tổng quát sau:

+
Chu trình lưỡng bội: Giai đoạn đơn bội tương đương với giao tử thể.
Giai đoạn bào tử thể chiếm ưu thế rõ rệt so với giai đoạn giao tử thể.

+ Chu trình hai thế hệ: Giai đoạn giao tử thể xen kẽ với giai đoạn bào
tử thể, hai giai đoạn này tương đương nhau.
+ Chu Trình đơn bội: Sự giảm phân nối tiếp ngay sau khi phối nhân để
tạo thành giao tử thể đơn bội. Giai đoạn lưỡng bội chỉ tồn tại trong một trạng
thái và thời gian ngắn.
+ Chu trình đơn bội song nhân: Đây có thể là biến dạng của chu trình
đơn bội, giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế hơn so với giai đoạn song nhân.

+ Chu trình vô tính: Đây là đặc trưng của nhóm nấm bất toàn, hoàn
toàn không có giai đoạn sinh sản hữu tính [10],[11],[12],[13]
1.2.2. Phân loại nấm
Nhiều tác giả đã đưa ra những hệ thống phân loại khác nhau. Mỗi hệ
thống đều có ưu, nhược điểm nhất định. Nhưng đều theo hai hệ thống phân
loại chung.
Hệ thống phân loại hình thái: dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một
số đặc điểm sinh lý sinh hoá và phương thức sinh sản.
Hệ thống phân loại dựa trên các phương pháp si
nh hoá và sinh học phân
tử. Nhưng hệ thống phân loại này được sử dụng rất ít. Các khoá phân loại phổ

Xem chi tiết: Nghiên cứu khả năng phân giải Cacbuahydro cùa một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ