Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trên cây cao su tại lai khê bằng phương pháp RFLP-PCR

TÓM TẮT

NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,
tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis
Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP –
PCR”.

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến
ThS. Phan Thành Dũng

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu
Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân
tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội.
Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu
về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng
lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô
cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền
đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP
– PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại
Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương.

Nôi dung nghiên cứu:
- Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola.
- Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và
ITS B.
- Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được.
Các kết quả đạt được:
- Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm
C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau.

- Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S
và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp.
- Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I,
EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi
cắt bằng 7 loại enzyme trên.
Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm
C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự
khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những
nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức
độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này.





















MỤC LỤC

PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các bảng xi
Danh sách các hình xii
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg 3
2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg
trên thế giới và tại Việt Nam 3
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến
sự phát triển của cây cao su 4
2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5
2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 6
2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei 6
2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 6
2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 7
2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng
của bệnh rụng lá Corynespora 8

2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều
cao su trên thế giới 9
2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10
2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR 10
2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng
đến kết quả phản ứng PCR 10
2.3.3.1. DNA mẫu 10
2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai 11
2.3.3.3. Enzyme 12
2.3.3.4. Mg
2+
12
2.3.3.5. dNTPs 12
2.3.3.6. Số lượng chu kỳ 12
2.3.3.7. Nhiệt độ và pH 13
2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR 13
2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR 13
2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR 14
2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR 14
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP 15
2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn 15
2.4.1.1. Giới thiệu chung 15
2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn 15
2.4.1.3. Các loại RE 16
2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE 17
2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) 17
2.4.2.1. Giới thiệu chung 17
2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP 17
2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR 18
2.6. Giới thiệu về vùng ITS 19
2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước 20

3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 22
3.1.1. Thời gian 22
3.1.2. Địa điểm 22
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu 22
3.2. Nội dung nghiên cứu 22
3.3. Vật liệu và phương pháp 22
3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối 22
3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 22
3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu 23
3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm 23
3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử 23
3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối 24
3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm 24
3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24
3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA 24
3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di 25
3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích 25
3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR 26
3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 26
3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR 26
3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di 27
3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 28
3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28
3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP 28
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola
trên một số dòng vô tính cao su 29
4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây

bệnh rụng lá Corynespora 29
4.1.2. Kết quả phân lập 32
4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử 32
4.1.4. Kết quả nhân sinh khối 35
4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 36
4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR 37
4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola 40
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
5.1. Kết luận 46
5.2. Đề nghị 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
7. PHỤ LỤC 52




















DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.
CLFP: Corynespora leaf fall disease.
cm: centimét.
dNTPs: deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
Kb: Kilobase pair.
m: mét.
mm: milimét.
Nu: Nucleotide.
PCR: Polymerase Chain Reaction.
PDA: Potato Dextrose Agar.
PGA: Potato Glucose Agar.
PSA: Potato Sucrose Agar.
R – M: Restriction – Modification.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid.
RE: Restriction Endonuclease.
RFLP – PCR: Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase
Chain Reaction.
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism.
rRNA: ribosome Deoxyribonucleotide acid.
TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate.
TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate.
Tm: melting Tempereture.
VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam





DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí cắt của nó 16
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR 26
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng enzyme cắt 28
Bảng 4.1. Tình hình nhiễm bệnh tại một số vườn
trên địa bàn Lai Khê – Bình Dương 30
Bảng 4.2. Các dòng nấm được tách đơn bào tử 33
Bảng 4.3. Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi 39
Bảng 4.4. Kích thước các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme giới hạn 44





















DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình dạng bào tử nấm C. cassiicola 7
Hình 2.2. Mô tả phản ứng RFLP 18
Hình 2.3. Sơ đồ vùng ITS của nấm 19
Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora 31
Hình 4.2. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường nhân tạo
(3 ngày sau khi cấy) 32
Hình 4.3. Bào tử nấm C. cassiicola 32
Hình 4.4. Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm 34
Hình 4.5. Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc 35
Hình 4.6. Kết quả li trích 24 dòng nấm khác nhau 36
Hình 4.7. DNA tổng số đã tinh sạch 37
Hình 4.8. Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) 38
Hình 4.9.Sản phẩm PCR theo quy trình mới 39
Hình 4.10. Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III 41
Hình 4.11. Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I 41
Hình 4.12. Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I 42
Hình 4.13. Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I 42
Hình 4.14. Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I 43
Hình 4.15. Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II 43
Hình 4.16. Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I 43









PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đối với thực vật thì những tác nhân gây thiệt hại về năng suất, chất lượng
chủ yếu là sâu hại, virus hoặc nấm gây ra. Trên cây cao su cũng vậy, đặc biệt là
các loại bệnh do nấm và vi khuẩn. Ngay từ khi xuất hiện, bệnh rụng lá do nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra đã gây thiệt hại rất lớn đối
với năng suất và chất lượng của nhiều cây trồng khác nhau (khoảng trên 11 loại
cây vùng nhiệt đới) như đậu nành, đu đủ, cao su…Từ đó, ảnh hưởng rất lớn đến
nền kinh tế của các quốc gia, đặc biệt là các quốc gia có thu nhập chính từ nông
nghiệp, trong đó có Việt Nam.
Đối với cây cao su bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra hay
còn gọi là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng
đối với ngành cao su ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới. Đợt dịch bệnh
bùng phát đầu tiên trên cây cao su vào năm 1985 đã gây rất nhiều sự chú ý của
các nhà khoa học. Cho đến nay, tính chất của bệnh rụng lá Corynespora càng
ngày càng nghiêm trọng, quy mô và phổ ký chủ càng ngày càng mở rộng. Đồng
thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Bệnh
này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng suất mủ của cây cao su.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999
tại các nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Nó đã gây ra cho
ngành cao su những mối lo mới và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của
ngành cao su. Lúc mới xuất hiện, bệnh chỉ xuất hiện trên một số ít dòng vô tính
như RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều dòng
vô tính bị nhiễm bệnh này.
Hiện trên thế giới đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora
cassiicola. Tuy nhiên những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ hình
thái cũng như đặc điểm sinh lý của nấm, còn những nghiên cứu về mặt sinh học
phân tử thì rất ít.
Để chuẩn bị cho những nghiên cứu sâu hơn về mặt sinh học phân tử của
nấm C. cassiicola tại Việt Nam, đồng thời được sự đồng ý của Bộ Môn Công

Xem chi tiết: Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trên cây cao su tại lai khê bằng phương pháp RFLP-PCR